ماهو PCR
- بادئ الموضوع xaxaxa
- تاريخ البدء
polymerase chain reaction PCR
تعرف هذه التقنية بالتفاعل السلسلي لإنزيم بلمرة الحامض النووي DNA وتعتمد فكرة هذا التفاعل على إمكانية تضخيم Amplification وإكثار وعمل ملايين النسخ من أي حامض نووي دون الحاجة لعزلة، حيث يمكن لهذا التفاعل أن ينتج 100 مليار جزيء من الـDNA من جزيء واحد فقط في لحظة البدء وخلال 6 ساعات فقط.
متطلبات تقنية PCR
خطوات تنقية الـ PCR:
1) يتم فصل الحلزون المزدوج لشريطي الحامض النووي إلى خيط مفرد عن طريق عملية الدنترة (المسخ) Denaturation بتسخينه إلى درجة حرارة من 94-95مْ.
2) يضاف البادئ المعروف تسلسله النووي إلى الحامض النووي المفرد و تتم بعد ذلك عملية تبريد وتقوية Annealing بخفض درجة الحرارة إلى 37مْ -65مْ اعتمادا على مدى التطابق بين البادئ المستخدم والحامض النووي.
3) يتم استطالة Extension للحامض النووي عند درجة 70-75مْ باستخدام الإنزيم المقاوم للحرارة.
يتم تكرار الثلاث خطوات من التسخين وتقوية واستطالة للحامض النووي باستخدام نفس الإنزيم السابق حتى يتم الحصول في النهاية على Unit length double stranded DNA .
وحاليا يستخدم جهاز ذاتي يعمل بمضاعفة جزيئات حامض DNA ويعرف باسم Automated Thermal Cycler وهو يستخدم الآن على نطاق واسع في معامل الأبحاث. وفي هذا الجهاز ترتفع درجة الحرارة آليا لإتمام عملية فك الشريط الحلزوني ثم تنخفض آليا لإتمام بناء الشريط موضح أدناه
مشاهدة المرفق 31467
An older model three-temperature thermal cycler for PCR
مشاهدة المرفق 31468
An old thermal cycler for PCR
تطبيقات PCR :
لتقنية PCR تطبيقات كثيرة في مجال أبحاث الحمض النووي (DNA ) و الوراثة ومنها :
1. الكشف عن الطفرات الوراثية : وذلك عن طريق وضع بريمر خاص للطفرة لتكثير الجين الخاص بها . ومنه نقوم بمعرفة المرض إذا كان على زوجين الكروموسومات أو على احدهما ( allele ) .
2. تعين البصمة الوراثية .
3. الكشف عن الفيروسات : وهذه الطريق هي الأدق في تحديد نوع وجنس الفيروس وكميته.
4. هو العنصر الأهم في عملية التجميع الجيني ( Recombinant الحمض النووي (DNA ) ) : حيث نقوم بتكثير الجين المراد إدخاله على البلازمد أو الحمض النووي (DNA ) المضيف .
5. استخدامه في تغير نهايات الجين لتصبح متوافقة مع إنزيمات القطع ( Restriction enzyme ) .
6. هو العملية الأساس في تحديد تتابع القواعد النيتروجينية في الحمض النووي (DNA ) ( الحمض النووي (DNA ) Sequencer ) .
7. معرفة طول الحمض النووي (DNA ) .
8. تقنية الحمض النووي (DNA ) المكمل ( cالحمض النووي (DNA ) ) .
9. تحديد الجين المطلوب من خليط من الجينات .
10. يستخدم في تقنية (microarrays ).
11. في مشروع الخارطة الجينية البشرية (human genome project ) .
12. الساوثرين بلوت (southern plot ) .
13. تقنية ارتباط الحمض النووي (DNA ) – بروتين ( الحمض النووي (DNA ) -Protein Interaction ) .
14. في مجال الطب الشرعي ( اختبار الأمومة ، حالات الاغتصاب ، تحديد الهوية ... الخ ) .
متطلبات تقنية PCR
- الحامض النووي المزدوج Double Stranded المحتوي على الجزء المطلوب نسخه.
- بادئ محضر صناعيا معروف نظام تعاقبه Oligannucleotid primer ويتكون من 20 نيوكليوتيدة .
- أنزيم بلمرة خاص مقاوم للحرارة ، ونجح الباحثون في الحصول على هذا الإنزيم وعزله من البكتريا المحبة للحرارة العالية المعروفة باسم Thermus aquatic
خطوات تنقية الـ PCR:
1) يتم فصل الحلزون المزدوج لشريطي الحامض النووي إلى خيط مفرد عن طريق عملية الدنترة (المسخ) Denaturation بتسخينه إلى درجة حرارة من 94-95مْ.
2) يضاف البادئ المعروف تسلسله النووي إلى الحامض النووي المفرد و تتم بعد ذلك عملية تبريد وتقوية Annealing بخفض درجة الحرارة إلى 37مْ -65مْ اعتمادا على مدى التطابق بين البادئ المستخدم والحامض النووي.
3) يتم استطالة Extension للحامض النووي عند درجة 70-75مْ باستخدام الإنزيم المقاوم للحرارة.
يتم تكرار الثلاث خطوات من التسخين وتقوية واستطالة للحامض النووي باستخدام نفس الإنزيم السابق حتى يتم الحصول في النهاية على Unit length double stranded DNA .
وحاليا يستخدم جهاز ذاتي يعمل بمضاعفة جزيئات حامض DNA ويعرف باسم Automated Thermal Cycler وهو يستخدم الآن على نطاق واسع في معامل الأبحاث. وفي هذا الجهاز ترتفع درجة الحرارة آليا لإتمام عملية فك الشريط الحلزوني ثم تنخفض آليا لإتمام بناء الشريط موضح أدناه
مشاهدة المرفق 31467
An older model three-temperature thermal cycler for PCR
مشاهدة المرفق 31468
An old thermal cycler for PCR
تطبيقات PCR :
لتقنية PCR تطبيقات كثيرة في مجال أبحاث الحمض النووي (DNA ) و الوراثة ومنها :
1. الكشف عن الطفرات الوراثية : وذلك عن طريق وضع بريمر خاص للطفرة لتكثير الجين الخاص بها . ومنه نقوم بمعرفة المرض إذا كان على زوجين الكروموسومات أو على احدهما ( allele ) .
2. تعين البصمة الوراثية .
3. الكشف عن الفيروسات : وهذه الطريق هي الأدق في تحديد نوع وجنس الفيروس وكميته.
4. هو العنصر الأهم في عملية التجميع الجيني ( Recombinant الحمض النووي (DNA ) ) : حيث نقوم بتكثير الجين المراد إدخاله على البلازمد أو الحمض النووي (DNA ) المضيف .
5. استخدامه في تغير نهايات الجين لتصبح متوافقة مع إنزيمات القطع ( Restriction enzyme ) .
6. هو العملية الأساس في تحديد تتابع القواعد النيتروجينية في الحمض النووي (DNA ) ( الحمض النووي (DNA ) Sequencer ) .
7. معرفة طول الحمض النووي (DNA ) .
8. تقنية الحمض النووي (DNA ) المكمل ( cالحمض النووي (DNA ) ) .
9. تحديد الجين المطلوب من خليط من الجينات .
10. يستخدم في تقنية (microarrays ).
11. في مشروع الخارطة الجينية البشرية (human genome project ) .
12. الساوثرين بلوت (southern plot ) .
13. تقنية ارتباط الحمض النووي (DNA ) – بروتين ( الحمض النووي (DNA ) -Protein Interaction ) .
14. في مجال الطب الشرعي ( اختبار الأمومة ، حالات الاغتصاب ، تحديد الهوية ... الخ ) .
D0uD0u
Active Member
بالعامى 
هو تفاعل يعمل replication لل دى ان ايه بتاعك. بمعنى عندك دى ان ايه dna وعايز تعمل منه نسخ كتيرة سواء كان الهدف تحليل فى معمل أو الهدف بحثى. الدى ان ايه اصلا ييتكون من شريطين ماسكين فى بعض فى شكل لولبى double stranded helix ووحدته اسمها nucleotide وهى 4 انواع A C G T . الشريطين دول متكاملين يعنى لو شريط فيه A حيبقى ماسك فيه فى الشريط التانى T , والC قدامها G , علشان اعمل التفاعل حاحتاج افك الشريطين من بعض وأضبف ال nucleotides و الانزيم المسئول عن اتمام التفاعل ، كل شريط من الشريطين اللى اتفكوا حيبقى اساس لدى ان ايه جديد لأن حاضيف له nucleotides تكون أساس للشريط التانى اللى ماسك فيه وبالتالى انتهى بنسختين بدل نسخة. بعد كده ال 2 دى ان ايه يتفكوا ويكونوا اساس ل 2 تانيين فيبقى عندى 4 وهكذا... يستمر التضاعف لغاية ما احصل على نسخ كتير. علشان تعمل التفاعل حتحتاج:
1- ال ادى ان ايه الى حتعمل عليه التفاعل بنسميه Template
2- dNTPs (ال nucleotides)
3- الانزيم واسمه دى ان ايه بوليميراز dna polymerase ومنه نوعين اساسيين مستخدمين فى المعامل Taq polymerse و Pfu polymerase الفرق بينهم انهم مسخلصين من كائنين مختلفين، والدقة لأن pfu بيقدر يصلح الأخطاء وعلشان كده غالى
4- primers ودى عبارة عن oligonucleotides أو جزء صغير من الشريط الموازى معمولة جاهزةوتروح تمسك فى واحد من الشريطين لما يتفك وبعدين يجى الانزيم ويكمل عليها ويضيف ال nucleotides الموازية االلى بعدها ودول لازم اضيفهم لأن الانزيم المستخدم لا يستطيع البدء من العدم (ما يقدرش يعمل de novo synthesis) ولكن بيحتاج حاجة يكمل عليها.
5 -buffer لضبطPH التفاعل
بتحط الخمسة مع بعض بنسب معينة مع ماء مقطر فى انبوبة صغيرة وتحطها فى الجهاز اللى اسمه Thermocycler . وتضبط البرنامج بتاع الجهاز. الجهاز ده حيغير الحرارة كذا مرة بنسب محسوبة ، علشان يسمح ان ال دى ان ايه الأصلى يتفك وبعدين علشان يسمح بتصنيع الدى ان ايه الجديد .. الخ ولما الجهاز بيخلص بيكون عندك الدى ان ايه مركز فتقدر تقوم عليه بابحاثك.
هو تفاعل يعمل replication لل دى ان ايه بتاعك. بمعنى عندك دى ان ايه dna وعايز تعمل منه نسخ كتيرة سواء كان الهدف تحليل فى معمل أو الهدف بحثى. الدى ان ايه اصلا ييتكون من شريطين ماسكين فى بعض فى شكل لولبى double stranded helix ووحدته اسمها nucleotide وهى 4 انواع A C G T . الشريطين دول متكاملين يعنى لو شريط فيه A حيبقى ماسك فيه فى الشريط التانى T , والC قدامها G , علشان اعمل التفاعل حاحتاج افك الشريطين من بعض وأضبف ال nucleotides و الانزيم المسئول عن اتمام التفاعل ، كل شريط من الشريطين اللى اتفكوا حيبقى اساس لدى ان ايه جديد لأن حاضيف له nucleotides تكون أساس للشريط التانى اللى ماسك فيه وبالتالى انتهى بنسختين بدل نسخة. بعد كده ال 2 دى ان ايه يتفكوا ويكونوا اساس ل 2 تانيين فيبقى عندى 4 وهكذا... يستمر التضاعف لغاية ما احصل على نسخ كتير. علشان تعمل التفاعل حتحتاج:1- ال ادى ان ايه الى حتعمل عليه التفاعل بنسميه Template
2- dNTPs (ال nucleotides)
3- الانزيم واسمه دى ان ايه بوليميراز dna polymerase ومنه نوعين اساسيين مستخدمين فى المعامل Taq polymerse و Pfu polymerase الفرق بينهم انهم مسخلصين من كائنين مختلفين، والدقة لأن pfu بيقدر يصلح الأخطاء وعلشان كده غالى
4- primers ودى عبارة عن oligonucleotides أو جزء صغير من الشريط الموازى معمولة جاهزةوتروح تمسك فى واحد من الشريطين لما يتفك وبعدين يجى الانزيم ويكمل عليها ويضيف ال nucleotides الموازية االلى بعدها ودول لازم اضيفهم لأن الانزيم المستخدم لا يستطيع البدء من العدم (ما يقدرش يعمل de novo synthesis) ولكن بيحتاج حاجة يكمل عليها.
5 -buffer لضبطPH التفاعل
بتحط الخمسة مع بعض بنسب معينة مع ماء مقطر فى انبوبة صغيرة وتحطها فى الجهاز اللى اسمه Thermocycler . وتضبط البرنامج بتاع الجهاز. الجهاز ده حيغير الحرارة كذا مرة بنسب محسوبة ، علشان يسمح ان ال دى ان ايه الأصلى يتفك وبعدين علشان يسمح بتصنيع الدى ان ايه الجديد .. الخ ولما الجهاز بيخلص بيكون عندك الدى ان ايه مركز فتقدر تقوم عليه بابحاثك.
D0uD0u
Active Member
ال RAPD هو نوع من انواع ال PCR (نوغ وبالتالى لا ينطبق عليه قبله وبعده). علشان اوضح لازم يكون خلفية اكتر فى البيولوجيا الجزئية بس حاحاول اوضح. لما بنيجى نشتغل PCR عادى بيكون عندنا معلومات كاملة عن ال template dna بتاعنا بمعنى اننا بنبقى عارفين ال nucleotide sequence بتاعه (عارفين كل مكان فيه اى nucleotide من الأربعة) وبالتالى باصمم ال primers اللى ذكرتهم فوق على هذا الاساس. يعنى مثلا لو انا عايزة أعمل replication لجزء معين من ال dna باعمل 2 primers يكونوا موازيين للمنطقتين المحيطين للجزء اللى أنا عايزة أكبره ويكونوا فى اتجاه عكس بعض بحيث ان الانزيم يكمل من الناحيتين لغاية ما يتقابلوا
======> dna i want to amplify <=======
السهمين عبارة عن ال primers وبناء عليه لازم اكون عارفة المنطقتين دول فيهم اى nucleotides فى الدى ان ايه الاصلى علشان اقدر اصمم primers مكملين لهم بالضبط
الفرق فى ال RAPD انى معنديش معلومات عن ال دى ان ايه الأصلى بتاعى وبالتالى ما بصممش primers لكن بأختار primers عشوائية.. وده عادة بيستخدم مع الكائنات اللى ما عنديش ال genomic sequence بتاعها كامل وغالبا لأهداف phylogenetic
بمعنى انى باستخدم مجموعة من ال oligos العشوائية اللى ممكن تمسك فى اى مكان فى الدى ان اى بتاعى (وممكن لا - انت وحظك) ولما أعمل replication اقدر استخدم ده فى معرفة ال sequence بتاع المنطقة اللى حصل لها replication
======> dna i want to amplify <=======
السهمين عبارة عن ال primers وبناء عليه لازم اكون عارفة المنطقتين دول فيهم اى nucleotides فى الدى ان ايه الاصلى علشان اقدر اصمم primers مكملين لهم بالضبط
الفرق فى ال RAPD انى معنديش معلومات عن ال دى ان ايه الأصلى بتاعى وبالتالى ما بصممش primers لكن بأختار primers عشوائية.. وده عادة بيستخدم مع الكائنات اللى ما عنديش ال genomic sequence بتاعها كامل وغالبا لأهداف phylogenetic
بمعنى انى باستخدم مجموعة من ال oligos العشوائية اللى ممكن تمسك فى اى مكان فى الدى ان اى بتاعى (وممكن لا - انت وحظك) ولما أعمل replication اقدر استخدم ده فى معرفة ال sequence بتاع المنطقة اللى حصل لها replication
انا سعيد جا بهذا الموضوع للمشاركة الرائعة للاخوان
وسعيد جدا لمشاركة الأخ AboJim فحاله دائما مشغول بالتضحية بوقته بتلبية طلبات الابحاث
لذلك انا سعيد انه وجد فسحة من الوقت ومساحة تفاعلية ربما تبعد عنه بعض الروتين
تحياتي للاخوان جميعا
وسعيد جدا لمشاركة الأخ AboJim فحاله دائما مشغول بالتضحية بوقته بتلبية طلبات الابحاث
لذلك انا سعيد انه وجد فسحة من الوقت ومساحة تفاعلية ربما تبعد عنه بعض الروتين
تحياتي للاخوان جميعا
استفسارات اذا كان لكم متسع من الوقت
حملت كثيرا من العروض وملفات الكتب الالكترونية لشرح RAPD ولكني لم استطع فهم كل نقطة بسبب اللغة
هل من الممكن ان توضحها لي ؟ وهل نبدأ من البداية (جميع خطوات PCR ثم الجيل ؟ وكيف تفهم المعلومات بصورة الجيل؟
وهذا رابط لشرح فقط بالصورة لكن لم افهم جزئياته بالضبط
http://www.up-00.com/dldrPY23070.rar.html
واعتذر اخيراً لكونه شيء جديد علي كلياً
شكراً للجميع
حملت كثيرا من العروض وملفات الكتب الالكترونية لشرح RAPD ولكني لم استطع فهم كل نقطة بسبب اللغة
هل من الممكن ان توضحها لي ؟ وهل نبدأ من البداية (جميع خطوات PCR ثم الجيل ؟ وكيف تفهم المعلومات بصورة الجيل؟
وهذا رابط لشرح فقط بالصورة لكن لم افهم جزئياته بالضبط
http://www.up-00.com/dldrPY23070.rar.html
واعتذر اخيراً لكونه شيء جديد علي كلياً
شكراً للجميع
sadalla2000
Active Member
السلام عليكم
[COLOR="red"]تعقيبا على ال PCR and RAPD[/COLOR]
تحياتى للجميع على هذة المواضيع القيمة و التى تعتبر جديدة و تحتاج الى فهم دقيق من جميع الجوانب خاصة توضيح الاجراء العملى بدقة مع فهم المواد و الاجهزة المختلفة المستخدمة فى هذا الجراء وايضا مع التركيز على النتائج و تحليلها على ال Gel Electrophoresis مع توضيح معنى المصطلحات المستخدمة كال Anamorphic and Polymorphic و مع توضيح مصطلح ال Diversity in plants .
اتمنى على الاخوة الذين عملوا فى هذا المجال و قدموا مشاركاتهم فى التوضيح ان يقدموا توضيحات اكثر و باستفاضة بالتفاصييل حتى تعم الفائدة للجميع و يستطيع الواحد الفهم عند قراءة اى بحث يتعلق بال RAPD
[COLOR="red"]تعقيبا على ال PCR and RAPD[/COLOR]
تحياتى للجميع على هذة المواضيع القيمة و التى تعتبر جديدة و تحتاج الى فهم دقيق من جميع الجوانب خاصة توضيح الاجراء العملى بدقة مع فهم المواد و الاجهزة المختلفة المستخدمة فى هذا الجراء وايضا مع التركيز على النتائج و تحليلها على ال Gel Electrophoresis مع توضيح معنى المصطلحات المستخدمة كال Anamorphic and Polymorphic و مع توضيح مصطلح ال Diversity in plants .
اتمنى على الاخوة الذين عملوا فى هذا المجال و قدموا مشاركاتهم فى التوضيح ان يقدموا توضيحات اكثر و باستفاضة بالتفاصييل حتى تعم الفائدة للجميع و يستطيع الواحد الفهم عند قراءة اى بحث يتعلق بال RAPD
biology2014
New Member
السلام عليكم
هل من الممكن أن أحصل شرح التقنية كاملة وباللغة العربية لأن المرفقات لاتفتح عندي وكذلك أنا بحاجة لهذا الموضوع كوني طالب دكتوراه ومحتاجه جدا
بارك الله فيكم
هل من الممكن أن أحصل شرح التقنية كاملة وباللغة العربية لأن المرفقات لاتفتح عندي وكذلك أنا بحاجة لهذا الموضوع كوني طالب دكتوراه ومحتاجه جدا
بارك الله فيكم